Non c’è un dato cronologico sicuro intorno al primo formarsi della biblioteca di famiglia, anche se è certo che esso va ricercato nella raccolta di memorie domestiche, e precisamente nei manoscritti dove ricorre il nome del casato; a questo nucleo più antico si aggiungono nel corso di 7 secoli altri manoscritti e documenti relativi alle attività e agli interessi dei membri della famiglia, oltre ad una considerevole collezione di libri a stampa.

I documenti più antichi sono carte e manoscritti membranacei quali l'importantissimo Capitulare nauticum (XIII-XVI sec.), la Promissio contra maleficia (sec. XIV), le Favole esopiane (sec. XIV), il codicetto con i Privilegi dei veneziani in Siria (XIII-XIV sec.), il Libro del Sarto (sec. XVI) e varie Commissioni ducali.

Tra i più appassionati raccoglitori di libri della famiglia sono da ricordare: Lauro Querini (1320-1466 ca.), umanista filosofo e lettore di Aristotele, a Rialto, nel Quattrocento; il cardinale Angelo Maria Querini (1680-1755), fondatore della Biblioteca Queriniana di Brescia, amico e corrispondente degli uomini più in vista del suo tempo, tra i quali Federico II di Prussia e Voltaire;
e infine Andrea Querini (1710-1795), "ragguardevole amatore e protettor delle lettere", come ebbe a chiamarlo il Cesarotti.

La storia moderna della biblioteca comincia con il conte Giovanni (1799-1869), ultimo discendente di casa Querini.
Giurista ed economista, con spiccata vocazione per le scienze fisiche matematiche e naturali, lascia, di questa sua inclinazione, larga traccia nelle collezioni librarie che cura e riordina continuando i cataloghi iniziati dai predecessori e colmando, ove possibile, le lacune.

Alla sua morte egli lascia in dono a Venezia il suo patrimonio per istituire una fondazione "atta a promuovere il culto dei buoni studj, e delle utili discipline". Nel suo testamento stabilisce fra l’altro che la Biblioteca dovrà rimanere aperta "in tutti quei giorni, ed ore in cui le Biblioteche pubbliche sono chiuse, e la sera specialmente per comodo degli studiosi".

I bibliotecari chiamati a dirigerla nei successivi 130 anni hanno cercato di mantenersi il più possibile fedeli al dettato testamentario e alla tradizione della famiglia Querini.

Uno tra i primi bibliotecari, Leonardo Perosa (bibliotecario dal 1880 al 1904), diede ordine al ricco settore dei manoscritti. Il suo Catalogo dei codici manoscritti della Biblioteca Querini Stampalia (luglio 1883), integrato dal Repertorio delle persone, dei luoghi e delle cose più notevoli contenute nei codici mss. della Biblioteca Querini Stampalia (1884), è tuttora in uso;

Arnaldo Segarizzi (bibliotecario dal 1905 al 1924) diede inizio ad un nuovo catalogo fondato sulle più recenti acquisizioni della scienza biblioteconomica: dall’adozione delle schede di formato internazionale, alla realizzazione di uno tra i primi esempi in Italia di catalogo per soggetti al posto del tradizionale catalogo sistematico, alla fusione infine in un’unica serie alfabetica delle schede per autore e di quelle per soggetto; il catalogo dizionario così ottenuto, tuttora in uso, rispecchiava l’idea di una biblioteca attenta alle esigenze di tutti i propri utenti, e non solo dei più dotti.
Alla sua cura è riconducibile anche l’arredo in legno scolpito tuttora presente nelle sale di lettura e la sistemazione secondo criteri di razionalità ed economia degli spazi di una parte dei depositi librari;

Manlio Dazzi (direttore dal 1926 al 1957) curò appassionatamente lo sviluppo delle varie discipline bibliografiche, con particolare riguardo (era uomo di lettere e fine poeta) a quelle umanistiche, e rese la Fondazione un centro vivacissimo di cultura letteraria, artistica e civile;

Giuseppe Mazzariol (direttore dal 1957 al 1974) ha dato all’Istituto la sua vitalità odierna "ritenendo che una biblioteca per essere viva debba assolvere prima di tutto ad una funzione di promozione culturale e civica".
Fu lui ad affidare a Carlo Scarpa il riordino del pianterreno e del giardino del palazzo dando alla Biblioteca maggiore visibilità e prestigio.

Negli ultimi decenni è continuata l’attività di ristrutturazione della sede e di ammodernamento e sviluppo dei servizi.

• Dal 1982 una convenzione con il Comune di Venezia riconosce formalmente alla Querini Stampalia quel ruolo di Biblioteca civica che ricopre nei fatti fin dall'inizio del '900, quando il Consiglio di Presidenza delibera di trasformare il Gabinetto di Lettura in una Biblioteca aperta ad una più ampia cerchia di lettori e in particolare agli studenti.
  Per effetto di tale convenzione, la Fondazione Querini Stampalia e il Sistema bibliotecario del Comune di Venezia collaborano attivamente per una gestione integrata delle strutture e dei servizi bibliotecari nel territorio del Comune.
• Nel 1987 la ristrutturazione dello scaffale aperto ha messo a disposizione degli utenti nelle sale di lettura circa 32.000 volumi ordinati secondo la Classificazione Decimale Dewey.
  
• Dalla fine degli anni ’80 la Fondazione fa parte del Polo veneziano di SBN (Servizio Bibliotecario Nazionale) e rende disponibili le notizie relative alle proprie acquisizioni (circa 4000 unità all’anno) all’interno del catalogo collettivo nazionale di SBN.
  
• E’ in corso anche il recupero del patrimonio retrospettivo, giunto attualmente a circa 20.000 unità; a fine 2002 è stato completato l’inserimento nel catalogo in linea di tutti i volumi collocati nelle sale a scaffale aperto.
  
• Nel dicembre 1999 è stata inaugurata la Biblioteca multimediale, gestita in collaborazione con la FEEM Fondazione ENI Enrico Mattei, una sala informatica con postazioni collegate a Internet e dotate delle più aggiornate dotazioni hardware e software.
  
• Da settembre 2001 è disponibile il servizio di emeroteca, che completa l’offerta dello scaffale aperto proponendo l’ultimo fascicolo e l’annata corrente di oltre 350 titoli di periodici relativi a tutte le aree disciplinari.
  
• Nell’agosto 2002 viene completata l’informatizzazione della Biblioteca. Nelle sale di lettura sono rese disponibili 15 postazioni dalle quali è possibile consultare i cataloghi in linea (OPAC).
• Dal primo marzo 2003 la Biblioteca, il cui orario serale e festivo era fino ad allora complementare a quello delle Biblioteche pubbliche secondo il dettato testamentario, ha anticipato l’apertura alle 10 del mattino, realizzando così un orario di servizio di 87 ore settimanali su sette giorni.
  
• Nel settembre 2003 si inaugura il nuovo deposito librario a scaffali compatti semoventi per una capienza complessiva di 120.000 posti libro.